免疫组化(IHC)实验流程

      免疫组织化学又称免疫细胞化学，是通过共价键将酶连接在抗体上，制成酶标抗体，再利用酶对底物的特异催化作用，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，于普通显微镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位 。目前通常选用免疫酶组化间接染色法进行实验，利用该技术，可进行细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。本文将具体介绍免疫组化的实验流程，为正在做这类实验的科研朋友提供帮助!

　　一、免疫组化(IHC)实验前准备

　　1、在实验开始前，要先确保该实验所用到的试剂都准备到位，如：不同浓度梯度的乙醇，PBS 缓冲液，3%过氧化氢，10%正常山羊血清，0.01M 枸橼酸缓冲液，DAB 显色液，二甲苯和抗体等。

　　2、本实验所使用到的仪器和耗材有：芬兰百得提供的移液器，赛默飞的 QSP盒装吸头、恒温箱，医用微波炉，盖玻片，镊子，洗瓶，湿盒，切片架等。

　　二、免疫组化(IHC)实验流程

　　1、脱蜡复水

　　首先对组织切片进行脱蜡复水处理：切片在室温放置 60min 后，浸泡在二甲苯中。10min 后，放入另一个装有二甲苯的染缸再泡 10min。脱蜡后，将组织切片逐级放入无水乙醇、95%、85%，75%，50%的乙醇中，每次处理均为 5min。水合处理后，将组织切片放入纯水中，孵育 5min，再转移放入 PBS 缓冲液中孵育 5min。

　　2、抗原修复

　　抗原表位修复之前，需进行内源性过氧化物酶的淬灭处理：滴加 3%过氧化氢溶液于切片上，湿盒孵育 10min。用 PBS 浸泡清洗 3 次，每次 5min，尽可能洗去残留的过氧化氢。将切片浸入 0.01M 枸橼酸缓冲液中，微波中大火力加热至沸腾并保持 8min，取出容器，待缓冲液温度自然降到室温。反复 2 次，用PBS 再洗 5min。

      3、免疫反应

　　用滤纸擦去周围多余的 PBS，滴加 PBS 稀释好的 10%正常山羊血清，室温湿盒封闭 30-60min。孵育结束后，去除封闭液，滴加一抗工作液，4°C 孵育过夜。第二天，移去一抗后，用 PBS 洗两次，每次 10min.擦去切片周围多余的液体，滴加二抗工作液，室温孵育 30min。弃去二抗后，PBS 洗两次，每次 10min。化学染色去除切片上多余的 PBS,滴加新鲜配制的 DAB 工作液，湿盒孵育，在显微镜下监测染色程度。染色结束后，PBS 浸泡洗去 DAB 染液，每次 5min，重复 3 次。去除残留液体，苏木素复染 2-5min，复染结束后，用水洗去多余染液，在 1%盐酸酒精中分化数秒。再次进行水洗切片。

　　4、脱水封片

　　此过程刚好和复水相反，首先进行50%乙醇处理5min，然后依次浸泡在75%，85%，95%和无水乙醇中，时间 5min，后置于二甲苯中进行透明化处理两次， 每次均为 10min。脱水处理后，擦去切片周围的液体，滴上 1 滴中性树胶，盖上盖玻片，用镊子的钝端轻轻敲击盖玻片，去除气泡以使封片完全。

　　5、结果观察

　　在显微镜下观察实验结果，并于相同的条件下拍取照片进行后续的结果分析。如图所示，苏木素复染细胞核后，细胞核被染上蓝色，实验组胞浆剪呈现棕黄色， 阳性信号较强;阴性对照组胞浆不被 DAB 染色。

　　6、半定量分析

　　(1)使用 Image Pro Plus 图像分析软件分析累积光密度值。打开 Image-Pro Plus软件，点击 File，打开实验组和对照组的结果图片。

　　(2)点击 Measure。Calibration，点击 Intensity 进行光密度校对。在 Intensity Calibration 窗口中，点击 New，选中 Std.Optical Density，点击 Optical，点击 Image，选择图中亮的一点。在 Incident Level 中输入与其接近的整十数，点击 ok。校正光密度后，点击Measure，Count/ Size。在Count Size 窗口，点击Measure，Select Measure，选择测量对象。选中 Area(面积)和 IOD(累积光密度)，点击 OK。

　　(3)回到Count /Size 窗口，点击Select Color。在Segmentation 窗口，选择Histogram Based，HIS 通道。调节饱和度等参数后，点击 Close。

　　(4)选中一张图片，在 Count Size 窗口，点击 View，在 Statistics 窗口可见结果。获得累积光密度值后，可选用相关软件进行统计学分析。