细胞侵袭实验原理及步骤

2018.11.12 19:24
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  对于进行细胞侵袭的研究者来说,传统试验方法具有染色及计数会占用实验者大量的精力,且数据单一,实验通量及重复性低等特点。本实验采用罗氏全新的方法来监测细胞侵袭,将CIM-Plate 16 结合 RTCA DP Analyzer 使用,这个独特的装置可在无标记条件下对细胞侵袭进行实时监控。CIM-Plate 16 由上室和下室组成,两者之间由微孔膜分隔开。金制串珠状微电极紧密结合,附着于 PET 膜下层, 并覆盖 80%表面积。趋化剂添加到下室,上室内添加研究的细胞和选择性添加细胞外基质胶。当细胞设法穿过膜,进入下室,黏附到电极上,系统可测量电阻抗变化。随着微孔膜下侧细胞数目的增多,电阻抗增大,表现为细胞指数的变化,并被RTCA DP Analyzer 记录下来。

细胞侵袭实验.png

  接下来,我们介绍整个细胞侵袭实验的流程

  一、编辑实验程序

  打开 RTCA software,可看到三个用户权限 ID,本次实验我们用 administrator 登录,密码为小写的administrator。user one 和user two 登录时无需密码。点击确认后,可根据实验需求进行选择适当的cradle。

  启动RTCA DP 软件后,如果软件仍停留在上一个实验界面,可以在 file 中点击 release, 开启一个新的实验。

  experiment note 页面下,填写本次实验的相关信息,包括实验名称,所使用细胞板的 ID number 信息等,备注栏内填写一些简单的实验设计。到 Layout 页面下,输入本次实验的设置,选中A1-H1,填写细胞系名称,细胞类型是HT-1080,每孔 20000 个细胞,点击apply, 设置信息完成。

  选择 A1-F1,本实验将从高到低浓度 Matrigel 进行包被,最高浓度为 10%,以 2 倍稀释度稀释,两个重复。选择 G1 和H1,填写 serum Free Medium 作为空白对照,保存后,将 A1-H1 信息复制到第二排。此时可见 16 孔板设置完成的实验信息。

  转到 schedule 页面,点击增加一步按钮。第一步是用于检测背景值的实验步骤,step-status 显示为 IDLE,表示未完成,请勿更改背景检测步骤参数。

  点击增加步骤按钮,建立第二个实验步骤,这里根据检测时间的长短,可以自行设计实验的检测次数及间隔时间。

  二、准备实验以及包被

  从冰箱中取出Assembling tool 以及 CIM plate 上板。拆开上板,可见板上和盖子上均有蓝点标记,将蓝点对蓝点,把板放在 Assembling tool 上。由于 CIM plate 板的电极是铺在孔膜的背部,所以上板不能直接接触桌面,安装时需特别注意。

  1、首先进行 Matrigel 包被,每孔内加入 50 µl matrigel ,每做完一个梯度,即 4 个孔后, 马上从孔内轻轻吸出 30µl Matrigel。如果出现气泡,用枪头小心剔除。

  2、空白对照的四个孔同样加入 50µl 的无血清培养基,然后吸出 30µl。

  3、盖上盖子,将整个 Assambling tool 连同板子 ,放入培养箱中孵育 4-5 小时,使 Matrigel凝结。

  三、组装 RTCA CIM Plate-16 以及测量 CI 背景值

  1、取出CIM plate 下板,蓝点对蓝点方向,放在 Assambling tool 第二个槽内,下板中加入160µl 预温好的完全培养基,动作缓慢且在最后轻抬枪头,可见整个液面形成漂亮的弧形。将 CIM-Plate 16 Assembly Tool 旋转 90 度,小心不要干扰液面将上板拿起,水平移到下板上方,快速用力扣下,中间不能有停顿,听到卡卡两声,表明上板和下板安装完成。检查安装是否紧扣在一起。

  2、在上板中每孔加入 30 µl 无血清培养基,盖上上板盖子将整块 CIM-Plate 16 放入 RTCA DP 分析仪。放在培养箱中平衡一个小时。

  3、一小时后,进入 schedule 页面,选中第一步,点击开始按钮。背景值测完后,显示 ready for starting next step.回到Message 页面,看是否有任何报错信息。

  四、准备细胞,并加入 RTCA CIM Plate-16 上腔

  1、取出CIM plate,重新放回到超净台中的 Assambling tool 上,每孔加入 100 微升含 20000 个细胞的细胞悬液。细胞准备参照本光盘的细胞传代及其他视频的相关操作,重悬 HT-1080 细胞。

  2、为了避免培养箱内由于温差产生蒸腾作用而引起边缘效应,将 CIM 培养板,在常温下静置半个小时。

  五、运行实验

  将 CIM plate 重新放回RTCA DP 分析仪上,看到提示 plate scanned, connection is OK 后,点击开始第二步。这时机器开始每 15 分钟检测一次孔内细胞的迁移的情况。

  六、实验结果分析

  在 Cell Plot 页面,选择显示平均值以及标准差,点击 add ,可见不同组得到的实验信号。如图所示,当 Matrigel 浓度最大时,细胞侵袭越困难,而无血清培养基对照孔内,细胞侵袭的信号就非常明显。根据包被 Matrigel 的浓度由高到低,细胞侵袭能力逐渐增强。

  七、注意事项

  1、CIM-Plate 16 不能重复使用:

  CIM-Plate 板上可能会有细胞或包被试剂的残留,影响再次实验的结果可靠性及重复性。

  2、健康的细胞培养物:

  健康的细胞侵袭效率较高,此外,较低的传代数能确保每次实验所用细胞的稳定性。实验细胞必须在前一天进行细胞传代,并保证消化时细胞融合达 60%-80%。

  3、Matrigel 使用要求:

  由于 Matrigel 非常容易在常温下凝结成胶状而无法使用,要将 Matrigel 置于冰上。侵袭实验前一天,需要将所需的 Matrigel 从-80 度取出,放在 4 度保存,使其溶解成液状,另外, 所有需要接触 Matrigel 的耗材,包括枪头,移液管,CIM plate 上板等需预先放在冰箱-20 或者 4 度预冷。

  4、无血清培养基制备细胞悬液:

  制备细胞悬液前可先让细胞去血清饥饿 12-24h,进一步去除上板中血清的影响,若上层中含血清,下层培养液的趋化作用就会减弱甚至消失了,影响实验的进行。


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