细胞冻存实验步骤及指导

2018.11.12 16:03
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细胞生物学研究中,为了更好而长期地研究细胞生物学功能,需要将良好状态的细胞保存起来,以备将来使用,这样可以省不少的人力物力。本文将介绍细胞冻存实验的具体步骤及指导,供大家参考学习!

细胞冻存实验.png

  1、细胞冻存实验所需材料:

  生长良好之培养细胞

  新鲜培养基

  DMSO (Sigma D-2650)

  无菌塑料冷冻保存管(Nalgene 5000-0020)

  0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)

  血球计数盘与盖玻片

  等速降温机(KRYO10SeriesII)

  2、细胞冻存实验运用的方法:

  (1)传统方法: 冷存管置于4 ℃10分钟--->-20 ℃30分钟--->-80 ℃ 16~18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。

  -20 ℃不可超过1小时,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80 ℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。

  (2)程序降温:利用已设定程序的等速降温机以-1~-3 ℃/分钟之速度由室温降至(-80 ℃以下)-120 ℃,再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

  3、细胞冻存实验的步骤:

  (1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基,使细胞处于指数生长期。

  (2)配制冷冻保存溶液(使用前配制):另取一离心管,加入培养基、血清,逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度,即制成双倍的冻存液,置于室温下待用。

  (3)离心收集培养之细胞,用加血清的培养基重悬起细胞,取少量细胞悬浮液(约0. 1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

  (4)取与细胞悬液等量的冻存液,缓慢逐滴加入细胞悬液,并晃动试管,制成细胞冻存悬液(DMSO最后浓度为5~10%),使细胞浓度为1~5×106cells/ ml,混合均匀,分装于已标示完全之冷冻保存管中,1~2 ml/vial,并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后,注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

  4、细胞冻存实验注意事项:

  (1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态,约为80~90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质,例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

  (2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间,而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

  (3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级,无菌且无色(以0. 22micron FGLP Telflon过滤或是直接购买无菌产品,如Sigma D-2650),以5~10 ml小体积分装,4 ℃避光保存,勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级,以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用,因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液,可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗,可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化,可换用10%甘油冻存。

  (4)冷冻保存之细胞浓度:

  ①normal human fibroblast:1~3×106cells/ ml

  ②hybridoma:1~3×106cells/ ml,细胞浓度不要太高,某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

  ③adherent tumor lines:5~7×106,依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度,而HeLa只需1~3×106cells/ ml

  ④other suspensions:5~10×106cells/ ml,human lymphocyte须至少5×106cells/ ml。

  (5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO,若是不确定细胞之冷冻条件,在做冷冻保存之同时,亦应作一个backup culture,以防止冷冻失败。

  (6)冻存可用10%~90%的血清,一般高浓度血清有助于维护细胞活力,此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时),复苏存活率在80%~90%以上,对原代培养细胞,以90%血清冻存更为有效。


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