细胞冻存实验步骤及指导

细胞生物学研究中，为了更好而长期地研究细胞生物学功能，需要将良好状态的细胞保存起来，以备将来使用，这样可以省不少的人力物力。本文将介绍细胞冻存实验的具体步骤及指导，供大家参考学习!

　　1、细胞冻存实验所需材料：

　　生长良好之培养细胞

　　新鲜培养基

　　DMSO (Sigma D-2650)

　　无菌塑料冷冻保存管(Nalgene　5000-0020)

　　0. 4%(w/v)trypan blue(GibcoBRL15250-061)

　　血球计数盘与盖玻片

　　等速降温机(KRYO10SeriesII)

　　2、细胞冻存实验运用的方法：

　　(1)传统方法: 冷存管置于4 ℃10分钟--->-20 ℃30分钟--->-80 ℃ 16～18小时(或隔夜)--->液氮槽vaporphase长期储存。

　　-20 ℃不可超过1小时，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80 ℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些。

　　(2)程序降温：利用已设定程序的等速降温机以-1～-3 ℃/分钟之速度由室温降至(-80 ℃以下)-120 ℃，再放在液氮槽vaporphase长期储存。适用于悬浮型细胞与hybridoma之保存。

　　3、细胞冻存实验的步骤：

　　(1)冷冻前24-48小时更换半量或全量培养基，使细胞处于指数生长期。

　　(2)配制冷冻保存溶液(使用前配制)：另取一离心管，加入培养基、血清，逐滴加入二甲基亚砜 (DMSO)至20%浓度，即制成双倍的冻存液，置于室温下待用。

　　(3)离心收集培养之细胞，用加血清的培养基重悬起细胞，取少量细胞悬浮液(约0. 1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。

　　(4)取与细胞悬液等量的冻存液，缓慢逐滴加入细胞悬液，并晃动试管，制成细胞冻存悬液(DMSO后浓度为5～10%)，使细胞浓度为1～5×106cells/ ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1～2 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。严密封口后，注明细胞名称、代数、日期。然后进行冻存。

　　4、细胞冻存实验注意事项：

　　(1)欲冷冻保存之细胞应在生长良好(logphase)且存活率高之状态，约为80～90%致密度。冷冻前检测细胞是否仍保有其特有性质，例如hybridoma应在冷冻保存前一至二日测试是否有抗体之产生。

　　(2)细胞在液氮中可长期冻存无限时间，而不会影响细胞活力;在-70度可保存数月。

　　(3)注意冷冻保护剂之品质。DMSO应为试剂级等级，无菌且无色(以0. 22micron　FGLP　Telflon过滤或是直接购买无菌产品，如Sigma D-2650)，以5～10 ml小体积分装，4 ℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。本方法中先制备双倍冻存液，可避免DMSO直接加入时释放的热量对细胞的损伤。缓慢逐滴加入细胞悬液是使细胞逐步适应高渗，可降低细胞受损。DMSO可能引起部分白血病细胞株的分化，可换用10%甘油冻存。

　　(4)冷冻保存之细胞浓度：

　　①normal human fibroblast:1～3×106cells/ ml

　　②hybridoma:1～3×106cells/ ml，细胞浓度不要太高，某些hybridoma会因冷冻浓度太高而在解冻24小时后死去。

　　③adherent tumor lines:5～7×106，依细胞种类而异。Adenocarcinoma解冻后须较高之浓度，而HeLa只需1～3×106cells/ ml

　　④other suspensions:5～10×106cells/ ml，human lymphocyte须至少5×106cells/ ml。

　　(5)冷冻保护剂浓度为5或10%DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

　　(6)冻存可用10%～90%的血清，一般高浓度血清有助于维护细胞活力，此处介绍20%终浓度有利于细胞悬浮而少沉积(4度时)，复苏存活率在80%～90%以上，对原代培养细胞，以90%血清冻存更为有效。