医学实验方法总结(5):分子机制—蛋白检测

2018.11.08 15:04
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  上一篇中给大家已经介绍了关于组织水平部分的实验方法,这次小编给大家带来的是关于蛋白检测的实验方法总结。蛋白质是由氨基酸脱水缩合形成的空间结构复杂的大分子有机物,其主要化学元素为C、O、N、H、S。

  一、蛋白质的检测方法

  传统:免疫印迹法、酶联免疫吸附试验

  常规:紫外线吸收法、凯氏定氮法、比色法

  高效液相色谱法、毛细管凝胶电泳法、近红外光谱法、质谱法、荧光法

  二、免疫印迹法

  1.实验概述

  蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot,它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色,通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。

  2.实验目的

  获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中的表达情况的信息。

  3.原理

  与Southern或Northern杂交方法类似,但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

免疫印迹法监测样品中特异蛋白质的基本流程.png

  4.步骤

  1)提取组织或细胞蛋白;

  2)测定蛋白质浓度 ;

  3)电泳:

  电泳条件为:恒压100V,待染料前沿移行到距离凝胶底部2-3mm时方可停止(约120min);

  4)电转膜仪转膜 :

  转膜条件为:恒流250mA ,2h(时间可根据目的蛋白分子量适当调整);

  5)封闭:5%脱脂牛奶室温封闭1h;

  6)加一抗:一抗封膜之后室温条件下摇1h然后放入4℃冰箱中过夜;

  7)收一抗,PBST洗膜3次,10min/次;

  8)二抗孵育:

  室温孵育1h,所用二抗的比例和种属见步骤9)表格。

  9)洗膜:PBST洗膜2次,PBS洗膜一次,10min/次。

  10)显色

  以上的信息就是关于蛋白检测的实验方法之一的相关介绍了,其他蛋白检测的方法详情可见附件中,大家可通过以下方式获取:

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