第三节:抗体那些事——如何选择抗体

2018.11.07 16:53
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随着生命科学的发展,针对蛋白质的研究越来越多,抗体试剂在实验中的重要性也越来越重要。面对复杂的抗体试剂市场,如何选择适合自身实验的抗体显得尤为重要。接下来就关说说抗体那些事之如何选择抗体,希望可以帮助到正在科研实验的朋友们!

科研实验图.png

  一、关于特异性的选择

  特异性的选择一般需要考虑四个方面:蛋白特异性、种属特异性、实验方法特异性、标记物的特异性。

  1、蛋白特异性:

  针对需要检测的蛋白查找抗体,几个细节要区分,重组表达的蛋白和内源性蛋白的检测,对抗体的要求是不一样的,注意查看抗体说明书的检测说明。如果重组蛋白不是全长表达,则需要注意抗体的免疫原区域是否在重组蛋白区域内。内源性蛋白最好能清楚其剪切与修饰的方式,特殊表型的蛋白需要进行序列比对,并结合抗体免疫原序列,查看交叉反应的情况。磷酸化蛋白检测需要确定具体位点,不同位点的磷酸化意味着可能有不同的机制存在,不宜一概而论。

  2、种属特异性:

  蛋白在不同的种属内表达,有着或大或小的差异。目前大部分商品化抗体都是以人源蛋白序列为模板重组蛋白或设计多肽抗原的,根据蛋白的同源性情况与其他种属发生交叉反应。需要参照说明书注明的可反应种属信息。一些稀有种属很难找到抗体,可以通过蛋白的序列比对,根据同源序列免疫的抗体,不过一般这种情况生产商不会受理其关于质量的申诉。

  3、实验方法特异性:

  目前使用抗体的实验方法有很多,不同的使用方法过程中,因为对蛋白样品的处理方式不一样,蛋白的含量也有差异,对抗体的识别表位和效价要求都是不一样的。具体的根据说明书注明的产品应用方法进行选择。但是生产商一般不会将每个抗体都进行各种实验的检测,目前检测比较多的只是WB、IHC等,如果针对具体的实验方法没有找到合适的抗体的,可以结合蛋白序列分析和抗体的抗原信息,选择尽可能有效果的抗体。

  4、标记物的特异性

  一般基于实验操作的实验方法不会使用带有标记的一抗,比如WB、IHC等,都是通过二抗类的试剂标记达到结果呈现的目的。但是基于仪器分析的一些实验,可能就会使用到直接标记的一抗,特别是流式实验。那么需要了解到自己将要使用的仪器能检测到的荧光范围,针对不通的参数要求选择对应的标记物。在免疫荧光双标实验中,需要选配不同的荧光标记物。

  二、抗体种属来源的选择

  有个大家普遍认为的观念,觉得单抗比多抗好,其实这并不是一个严谨的观点,只能说在可能性上单抗的特异性更好一些。目前商品化抗体里单抗主要是鼠单抗和兔单抗,多抗主要是兔多抗、山羊多抗等,其他种属来源抗体较少。不建议纠结于单抗好还是多抗好,能做出实验的抗体就是好抗体。

  在选择上一般建议实验种属和抗体种属亲缘性越远越好,不宜同源。不同种属主要影响下面二抗的选配。特别是在免疫荧光双标实验中,需要在区别于实验种属的基础上,区分开两个指标的抗体种属来源,以便于二抗分别识别。

  三、关于性价比的选择

  抗体的品质高低最终还是需要通过实验结果来呈现的,但是在选择抗体之前我们并无法准确判断抗体的效果如何。无论什么品牌的,无论进口还是国产的,都会有用得不错的抗体,也都会有做不出来的产品。抗体属于异质化产品,不同品牌之间,甚至同一品牌的不同产品之间,抗体品质差异都较为明显,而且是没有统一的衡量标准的。这是抗体选择中最难的一个问题。很多人习惯于根据实验室传统意识或参考文献上使用的产品进行选择,但是因为不同批次间的抗体效果也是有差异的,所以也不能完全确保正确选择。在这种情况下,抗体的售后就尤为重要,就是如果真的遇到抗体品质障碍时,如果能够确保有效得解决问题,不至于影响实验的进展。现在有部分品牌供应商可以提供免费的小样的,无疑对这个问题有一个很好的解决方案。先确定抗体是否适合自己的实验,可以避免因为抗体质量投诉耽误实验安排。

  在价格方面,需要谨记,最贵的不一定就是最好的,最适合你的实验的才是最好的。花很多买到很贵的抗体,再花上很长的时间去投诉的情况并不少见。只买对的,不买贵的。同时很多老品牌提供的抗体产品基本都是以大包装为主,就单个课题的实验而言,过大的包装有时会造成很大的浪费。目前Proteintech、Bioworld、Cell Signal等品牌都相继推出小包装的抗体,这在一定程度上给选择者更大的选择自由度,可以根据试用产品的效价,计算出自己实际需要的抗体量,做到精确定量采购。

  四、关于品牌的选择

  因为对抗体品质的异质化,关于抗体的品牌选择被大家所重视,但是不管是什么品牌都难免会遇到不适合自己的抗体。所以一般建议考虑那些大家普遍认可、购买方便、技术支持专业、售后处理便捷的品牌。一些甚至都没有正式代理的,只能备选。同时购买时一定要找那种能够提供产品指引、实验分析、售后处理的正规代理商购买,避免因为买到假货水货影响实验。

  五、关于其他一些抗体选择小细节

  抗体选择与使用过程中,多少还会遇到一些意想不到的事情。有些细节,还是需要多注意一些。如在选择做阻断或中和实验时,有时需要将抗体加到细胞培养液中,这是需要注意抗体是否含有叠氮钠。如果是大包装的抗体,进行分装是比较节约的方式,如果是高效价的,可以配成母液再分装。抗体的短时间运输,用普通冰块保持温度是可以满足要求的。

  另外不要纠结于WB过程中分子量的问题。很多时候,我们看到相同的抗体,不同的品牌,甚至相同的品牌,不同的产品编号,标记的分子量是不同的。事实上,制造商可能只使用不同的物种,不同的样品类型,或参考不同的文献。对于用户,相同的样品,无论使用哪个品牌,只要抗体是正确的,目标带只会出现在相同的位置。关于分子量,一般不推荐看产品描述。WB中带的位置由样品决定,且不随抗体而变化。因此,在检测蛋白质之前,我们可以通过数据库或参考文献全面了解待检测的蛋白质,包括其可能的剪切和修饰、表型等。第一次使用新的抗体时,不根据横向剪切膜的分子量,可以保留几个全泳道,看看条带位置或分布的情况。


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