巢式PCR概述和实验操作步骤

2018.11.05 14:31
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一、巢式PCR概述

  巢式PCR是一种变异的聚合酶链反应(PCR),使用两对(而非一对)PCR引物扩增完整的片段。第一对PCR引物扩增片段和普通PCR相似。第二对引物称为巢式引物(因为他们在第一次PCR扩增片段的内部)结合在第一次PCR产物内部,使得第二次PCR扩增片断短于第一次扩增。巢式PCR的好处在于,如果第一次扩增产生了错误片断,则第二次能在错误片段上进行引物配对并扩增的概率极低。因此,巢式PCR的扩增非常特异。

  巢式PCR一般应用于动物方面。如:病毒,梅毒螺旋体,HIV,肿瘤基因等。

巢式PCR原理示意图.png

  二、巢式PCR实验操作步骤

  实验材料:基因样品、PCR缓冲液、Tris·HCl、KCl、Taq聚合酶、PCR仪

  实验步骤:

  1. 目标的DNA模板蓝色的第一对引物结合。第一对引物也可能结合到其他具有相似结合位点的片段上并扩增多种产物。但只有一种产物是目的片断(图中未显示可能的多种产物)。

  2. 使用图中红色标记的第二套引物对第一轮PCR扩增的产物进行第二轮PCR扩增。

  第一轮

  1. 大小:1192 bp

  2. 初始孵育:94℃4分钟

  3. 变性:94℃45秒

  4. 退火:58摄氏度45秒

  5. 聚合:72摄氏度45秒

  6. PCR循环:36

  第二轮

  1. 大小:271 bp

  2. 初始温育:95℃2分钟

  3. 变性:95℃45秒

  4. 退火:60℃下45秒

  5. 聚合:72摄氏度30秒

  6. PCR循环:36


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