磷酸化蛋白的western blot检测操作经验

　　磷酸化蛋白的western blot检测操作经验

　　蛋白质磷酸化是在蛋白质激酶催化下，把ATP的磷酸基转移到其他蛋白质氨基酸残基。蛋白质磷酸化主要发生在两种氨基酸上，一种是丝氨酸(包括苏氨酸)，另一种是酪氨酸。蛋白质磷酸化是生物体内一种普通的调节方式，在细胞信号转导的过程中起重要作用。

　　磷酸化蛋白的western blot检测操作步骤如下：

　　一、收蛋白样

　　1、 收蛋白样一定冰上操作，动作要快，防止磷酸化蛋白的降解;

　　2、 蛋白裂解液配置：蛋白裂解液RAPI：蛋白酶抑制剂PMSF=100:1, 因为蛋白裂解液RAPI中含有NaF(抑制酸性磷酸酶)，所以不加磷酸酶抑制剂也是可以跑出很漂亮的条带;

　　3、 如果自己配置的蛋白裂解液不含磷酸酶抑制剂，为了防止磷酸化蛋白的降解，可根据需要另行添加磷酸酶抑制剂(氟化钠NaF：抑制酸性磷酸酶，使用浓度10mM; 正钒酸钠Na3VO4：抑制碱性磷酸酶和酪氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM;焦磷酸钠Na2P2O4：抑制丝氨酸-苏氨酸磷酸酶，使用浓度1 mM);

　　4、 蛋白裂解后4℃离心后，好立即加入loading buffer进行煮沸变性，也是防止磷酸酶降解磷酸蛋白。蛋白变性后你就可以稍微心安了，不用再小心翼翼害怕磷酸化蛋白降解了。

　　二、转膜

　　转膜的时间根据磷酸化蛋白的大小，分子量大时间就长点;分子量小，时间就短点，不可转膜不完全，也不可把膜转过头了。这样都将导致磷酸化蛋白量少，条带过淡。

　　三、封闭

　　1、常温封闭即可，转速不可过高，40-50转即可;

　　2、做一般蛋白的话，我们常用5%的脱脂奶，但如果做磷酸化的蛋白，好用5%的BSA。

　　四、抗体

　　1、 一定选大公司的抗体，比如CST，毕竟磷酸化蛋白不好做，以免费时费力，小心翼翼很多步，后毁在抗体上，得不偿失;

　　2、 一抗好好4度过夜，确保抗体充分的结合;

　　3、 二抗正常室温2h，转速不可过大;

　　4、做磷酸化蛋白，好总蛋白水平也跑一下，因为到时候发文章评委也会提这样的问题，避免以后补实验，不要给自己找麻烦啊!这是为什么呢?评委难为我，No, No, No!那是因为总蛋白水平包括磷酸化蛋白和非磷酸化蛋白，蛋白的磷酸化激活是体内磷酸化蛋白占总蛋白的比值，而不是单一看磷酸化蛋白的表达，磷酸化蛋白的改变是因为处理某种作用下总蛋白表达的变化所引起的，还是蛋白激酶活化磷酸化蛋白水平增加而引起的。

　　五、曝光

　　加ECL显影剂，如果条带过淡，可延长曝光时间;如果杂带过多影响目的条带的额曝光，可遮住杂带部分再次曝光。

　　六、注意事项

　　1、一定要在 lysis buffer 中加入蛋白酶抑制剂(配方见后页)，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使 band压出来也会很浅，结果也不可信。

　　2、加一抗后好 4 度过夜，保证抗体有充分的结合时间。因为磷酸化的蛋白只占总的蛋白量的极少部分。 4 度也可使一抗重复使用多次(站长注： 可加入防腐剂，如叠氮钠， ProclinTM 等，保存时间更长)。毕竟磷酸化的抗体都挺贵的。二抗则室温 1 小时即可。

　　3、磷酸化抗体的好坏是一个关键因素，所以要选择好的厂商。个人认为， Cell signaling 公司做的磷酸化抗体不错，尤其是 MAPKs 磷酸化抗体

　　4、抗体的稀释倍数也要适当。不同厂商也会有不同要求。

　　5、 研究完某一蛋白的磷酸化情况后好也要研究一下该蛋白总的表达量。如压完 phospho-p38 抗体后，我会把相同的 membrane 做 strip 后再压 p38, 然后再 strip 一次，再压内标 actin 。

　　6、磷酸化蛋白 WB 时 , 用 TBST 洗时也要注意一下 , 摇床的转速不要太快 , 洗的时间不要太长 , 孵育一抗和二抗之后分别洗 5min 3 次即可 , 宁愿 background 深一些 , 总比做不出来强得多 . 另外，洗的时候，好不要把几张membrane 叠在一起洗。