如何提取质粒

2018.10.26 17:27
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质粒抽提方法即去除 RNA,将质粒与细菌基因组 DNA分开,去除蛋白质及其它杂质,以得到相对纯净的质粒。那么如何提取质粒呢?步骤有哪些?接下来小编就围绕如何提取质粒的问题为大家整理了一些提取质粒的详细步骤,供大家参考学习!

  质粒的提取 (Tiangen质粒提取试剂盒 )步骤如下:

  1、挑菌:选取培养板中大小中等的单个菌落,消毒牙签接种到 10ml 摇菌管中,其中含有卡那霉素的 LB 约5ml ,37 °C,220rpm恒温摇床中震荡培养过夜。

  2、取上述 2.0ml培养液,于常温下 12000 rpm离心1分钟,弃上清,干燥沉淀。

  3、 加入250μl溶液P1(配有去 RNA 酶,4 °C保存),涡旋振荡, 完全悬浮细菌,不能留有沉淀,否则会影响裂解。

  4、 加入 250μl溶液P2,快速上下颠倒 8次,常温静置 3分钟,可见混合液逐渐变清、粘稠,表示已充分裂解。

  5、再加入350 μl溶液Ⅲ,快速上下颠倒 8次,可见白色絮状物出现。

  6、 常温12000rpm离心10分钟,所得上清液倒入已经用 BL平衡过的过滤柱中, 注意不要倒入白色絮状物沉淀,静置 3分钟, 12000 rpm离心1分钟。

  7、 加入 500 μl 溶液PD,12000 rpm离心1分钟。

  8、 加入 600 μl 溶液PW,12000 rpm离心1分钟;此步骤再重复 1次;弃废液后空管再次 12000 rpm离心2分钟。

  9、于超净台通风干燥,放置 2-5分钟,加入 33μl 已加热至 65 °C的已灭菌的 ddH2O,室温静置 3分钟, 12000 rpm离心2分钟,得到相关质粒 DNA ,测浓度, -20 C°保存备用。


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