慢病毒纯化、浓缩的两种方法及步骤

2018.10.26 14:29
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       慢病毒纯化和浓缩实验的主要试剂:

  1. 70%乙醇

  2. 20%的蔗糖溶液

  3. PBS缓冲液

  慢病毒纯化和浓缩实验的主要设备:

  1. Ultra-clear SW28离心管

  2. 超净工作台

  3. 紫外灯

  4. 10ml移液管

  5. Beckman SW28 超速离心转头

  6. 高速离心机

  7. 50ml锥底离心管

  8. 低温冰箱

  慢病毒的浓缩和纯化方法一:PEG-8000 浓缩法

  PEG (聚乙二醇)是高分子聚合物,具有高亲水性,在溶液中会吸收大量水分,减少病毒之间的距离,使病毒与病毒能够很容易的聚合在一起,病毒的相对浓度提高,达到沉淀浓缩的目的。

  5X PEG8000+NaCl 配制称取 NaCl 8.766 g; PEG8000 50g 溶解在 200ml Milli-Q

  纯水中; 121 摄氏度 30min 湿热灭绝 30min ;保存在 4 ℃ 。

  1. 使用 0.45 μm滤头过滤慢病毒上清液;

  3. 每 20 ~ 30min 混合一次,共进行 3-5 次;

  4. 4 度放置过夜;

  5. 4 度, 4000 g ,离心 20min ;

  6. 吸弃上清,静置管子 1 ~ 2 分钟,吸走残余液体;

  7. 加入适量的慢病毒溶解液溶解慢病毒沉淀;

  8. 集中后的病毒悬液分装成 50 μl每份,保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃。

  慢病毒的浓缩和纯化方法二:超速离心沉淀法

  1. 取 6 个 Ultra-clear SW28 离心管,用 70% 乙醇消毒后,放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒 30 分钟。

  2. 每 个 Ultra-clear SW28 离心管中加入约 32ml 的预先处理的病毒上清液。

  3. 取一支 10ml 的移液管,吸取 12 ml 20% 的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部,缓慢将蔗糖溶液打出 4 ml 。同样地,将剩下 8 ml 的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管,对剩下 3 管进行同样处理。

  4. 用 PBS 调整各管的重量,使对应的离心管之间的重量相差不超过 0.1g 。

  5. 按次序将所有 6 个离心管放入 Beckman SW28 超速离心转头中。

  7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清,将离心管倒扣在纸巾上放置 10 分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。

  8. 每管中加入 100ml 不含钙和镁的 PBS 洗下沉淀。

  9. 将 SW28 超速离心管插入到 50ml 锥底离心管中,盖上盖子。

  10. 在 4 ℃ 溶解 2 小时,每隔 20 分钟轻轻震荡。

  11.4 ℃ ,500g 离心 1 分钟,使溶液集中于管底。

  12. 用 200 μ l 移液器轻柔吹打使沉淀重悬。避免产生泡沫。将所有管中的液体集中到一个 SW28 离心管中。

  13. 集中后的病毒悬液分装成 50 μ l 每份,保存在成品管中。用碎干冰速冻后储存在-80 ℃ 。


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