原代肝细胞培养技术经验

2018.10.25 16:07
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  原代肝细胞培养技术经验

  肝细胞作为细胞移植治疗慢性肝衰竭的种子细胞以及作为药物筛选的靶细胞,制备和培养大规模的、高活力的肝细胞是这些研究的最基本环节。因此肝细胞的分离和培养技术正日益受到人们关注,成为当前研究的热点。今天小编给大家整理了一些关于原代肝细胞培养技术经验,供大家参考学习!

  一、肝细胞培养液的组成(以100ml培养液为例)

  DMEM90ml,10%胎牛血清10ml,肝细胞生长因子1-2ug,双抗(100乘)1ml,胰岛素500U/L、地塞米松0.4mg/L

  二、关于培养液添加内容的解释

  肝细胞培养液中是否要添加肝细胞生长因子。重组人肝细胞生长因子(r—hHGF)是最强的促肝细胞分裂剂,在一定剂量范围内,r—hHGF与肝细胞DNA的合成有明显的量效关系。

  肝细胞生长因子的剂量问题:1ng/ml r-hHGF即可引起DNA合成显著增加;10ng/ml时DNA合成效应最大,继续增加r-hHGF的剂量会出现抑制效应。

  该实验结果可观察到,r-hHGF5ng/ml的刺激效应与10ng/ml的相差无几。这提示我们,为了节省试剂,在以后的实验中可采用5ng/ml的剂量。Strain等研究证明 ],从人血浆中提取并纯化的hHGF刺激原代培养大鼠肝细胞合成DNA的半最大剂量为1—2 ng/ml(1O一20 pmol/L)

  肝细胞生长因子作用时间的问题;表现为r-hHGF作用24小时,DNA 合成量明显高于对照组(P<0.01),48小时作用达最高(P<0.001),随后开始下降,至96小时下降到相当于24小时的水平。(肝细胞生长因子刺激大鼠离体肝细胞DNA合成的剂量一与时间一效应)

  青霉素100u/ml,链霉素100ug/ml:防止污染

  胰岛素10-8mol/L,地塞米松10-6mol/L促进贴壁

  三、组织块法肝细胞分离

  采用胰酶、胶原酶两步消化法和低速多次离心法进行肝细胞分离。将出生后第3天的SD大鼠断头处死放入750ml/L乙醇中消毒10min,无菌采取肝,置冰冷PBS中,撕去肝包膜,剪碎后加入0.5mg/L的胰酶中37℃振荡消化20min,弃去上清后,再用2mg/L的IV型胶原酶37℃振荡消化20min,用含10% 胎牛血清的DMEM-HG终止消化,吹打2min,静置使肝组织块沉于消化瓶的底部,取上清收集细胞悬液,以800r/min离心5 min,弃上清,加入含10% 胎牛血清的DMEM-HG培养液,调整细胞浓度以5×10/ml接种于50ml培养瓶内,37"C、5 %C02、饱和湿度静置培养。用200目孔径网筛过滤,细胞悬液在4℃条件下800r/min离心3min,反复离心3次。沉积的细胞用含100ml/L胎牛血清的DMEM培养液调整细胞密度为5*105/ml,台盼蓝染色测定肝细胞活力。将调整好密度的细胞接种在胶原包被的培养板中,培养24小时后换液,去掉红细胞。采用过碘酸-雪夫反应鉴定肝细胞。

  四、取肝细胞注意事项

  取大鼠肝脏细胞前需要禁食12h

  非灌流分离肝细胞法,该法直接将离体肝脏置于冷的培养基中,切碎,加入溶解酶破换肝细胞间连结,再经过振动、沉淀,最后在上清液中得到游离的肝细胞。(游离肝细胞培养技术在肝脏毒理学研究中的应用)

  洗涤液D-hanks液,用眼科剪剪成1mm3左右的碎块,使其成糊状。

  五、肝细胞培养过程中造成肝细胞损伤的问题

  原代培养的大鼠肝细胞的代谢功能较其他细胞更为敏感,本实验中由于肝细胞分离时细胞膜完整性的损伤,细胞需要在体外逐渐的修复,在培养第3天细胞活力(MTT实验A值最大)达到高峰,合成和分泌功能完好,LDH漏出也较低,细胞达到最佳状态,与其他研究结果一致。(全反式视黄酸对大鼠原代肝细胞铁代谢的影响)

  六、Pereol1分离液:Pereol1分离液以9份Percoll原液,加入1份10 X PBS,制成缓冲的Percoll液,再用1 X PBS调整Percoll液密度为1.08—1.09 kg/L。若肝细胞的活率在90%以下,则加用Percoll细胞分离液进一步纯化。8 mL肝细胞悬液悬浮于密度为1.08—1.09 kg/L的20 mL Percoll液上,5 000 r/min离心5 min,弃上清,PBS清洗肝细胞1次,500 r/min,3 min。

  肝细胞的接种 活力在90% 以上的肝细胞按1 X l05密度接种两组6孔板,每孔加入3 mL Hepa.toZYME—SFM肝细胞培养液,于37℃ 、5%co2条件下培养。培养4—6 h待肝细胞贴壁后即更换培养液,其后每3 d换液1次。(长期培养的大鼠原代肝细胞功能和形态学观察)

  七、(1)培养瓶紫外过夜,高压后的1×PBS 10ml备用

  (2)计算胶原溶液浓度:查文献得胶原浓度为10μg/cm2(储存浓度为4mg/ml),一般中等大小的培养瓶为25cm2,计算[(10×1/1000 mg/cm2)×25cm2]/4mg/ml可得出每个培养瓶需要的胶原量

  (3)先在高压后15ml离心管内加入5ml 1×PBS,再用枪吸取计算好的胶原用量,注入PBS里,混匀

  (4)将配好的胶原溶液缓缓注入培养瓶中,将培养瓶水平放在超净台里,可用紫外照,15-30min后,将PBS贴壁吸出,尽量吸干净,再将培养瓶放入超净台里照紫外,等胶原干后即可使用。

  (5)如果放在超净台里保存,一周内仍可有效。注:1、所有操作均在超净台里无菌操作2、胶原为collage type I(Upstate)液态浓度为4mg/ml,无菌。3、PBS最好新鲜配置,高压后放在超镜台里冷却至室温

  (6)胶原一定要充分混匀,否则铺板时凸凹不平

  (7)胶原包被后,最好不要用紫外线照,会破坏胶原结构,注意无菌操作即可。2。使用前,用温热的不含血清的培养基洗一次后,再用。


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