石蜡切片免疫组化染色实验流程

2018.10.22 16:33
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  石蜡切片免疫组化染色实验流程

  免疫组化的方法很多,新方法层出不穷,虽然这些方法各有其特色,但总的来说,只要应用恰当均可获得较为满意的结果。方法的选择并不是影响免疫组化结果的主要因素。今天详细介绍石蜡切片免疫组化染色实验的流程,供大家参考!

  实验原理:

  用化学交联法将酶与抗体分子连接,染色时在特异性抗体与标本中抗原结合之后,用桥抗体结合于其上,再将抗酶抗体结合于桥抗体上,最后把酶结合在酶抗体上,经过底物的呈色反应而将抗原显示出来。此实验方法优点是提高了方法的敏感性,非特异染色较轻。

  石蜡切片免疫组化染色实验流程如下:

  1.石蜡切片脱蜡至水:(石蜡切片染色前应置 60℃ 1 小时) 。

  ① 二甲苯 、II,各 10 分钟。

  ② 梯度酒精:100%,2 分钟 95%,2 分钟 80%,2 分钟 70% 2 分钟。

  ③ 蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床)。

  2.过氧化氢封闭内源性过氧化物酶:3%H2 O2 ,室温 10 分钟(避光) 。

  3.蒸馏水洗:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  4.抗原修复:根据待检测的抗原,选择适当的方法。

  附:抗原修复液(10mMpH 6.0 枸橼酸钠缓冲液)的配制:① 储备液的配制:A 液:枸橼酸三钠- 2H2O 29.41g + 蒸馏水 1000ml;B 液:枸橼酸 21g + 蒸馏水 1000ml;② 工作液的配制:A 液 82ml+ B 液 18ml+ 蒸馏水 900ml

  抗原修复的方法: ① 高压锅处理技术:枸橼酸钠缓冲液(10mM,PH6.0),淹没切片,盖上锅盖,高压锅内煮沸,上汽 3 分钟后缓慢冷却(可用自来水在高 压锅外冲,以助冷却) 。②微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内,枸橼酸 钠缓冲液淹没切片,选择中高或高档,5 分钟;取出并补充已预热的 枸橼酸钠缓冲液; 再选择中高或高档,5分钟(.最佳温度为 92 95℃)③ 酶消化处理。

  抗原修复的注意事项:① 组织不能干。 ② 选择抗原修复方法要因抗体而异。 ③ 该方法主要用于 10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。④ 抗原修复后至 DAB 显色的过程中,均需用 PBS 缓冲液。

  5.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  6.正常血清封闭:从染片缸中取出切片,擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分 (保持组织呈湿润状态,)滴加正常山羊或兔血清 (与第二抗 体 同源动物血清)处理,37℃,15 分钟。

  附:正常血清配制 ( 或按试剂盒规定的浓度配制):按 1:20比例,用 PBS 配制,每张切片需要量按 50μ+5μl (10%抛洒量) 计算。

  7.滴加第一抗体:用滤纸吸去血清,不洗,直接滴加第一抗体,37℃ 2 小时(也可置于 4℃冰箱过夜) 。

  8.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  9.滴加生物素化的二抗,37℃,40 分钟。

  10.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  11.滴加三抗 (SAB 复合物) ,37℃,40 分钟。

  12.PBS:5 分钟,2 次(置于摇床) 。

  13.DAB 显色,镜下观察,适时终止(自来水冲终止) 。

  附:DAB 的配制① 储备液(DAB 25mg/ml)的配制:DAB 250mg + PBS 10ml,待完全溶解后分装成 1ml,100μl,50μl ,20μ l 等,-20℃,冻存。② 工作液:DAB 储备液 20μl + PBS 1000μl + 3% H2O2 5μl

  14.自来水(细水)充分冲洗。

  15.苏木素复染,室温,30 秒,自来水冲洗。

  16.自来水冲洗返蓝,15 分钟。

  17.梯度酒精脱水:80%,2 分钟 95%,2 分钟 100%,2 次,5 分钟。

  18.二甲苯透明:I ,II (二甲苯)各 5 分钟

  19.封片:加拿大树胶(或中性树胶)封片。


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