实验技术:双酶切连接反应的全部攻略

2018.10.18 18:03
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做转化时,进行酶连接反应,注意保持低温状态,因为LIGASE酶容易降解。为了安全起见,一般连接3小时,16度;对于含有AMP抗性板的质粒,在加入AMP时注意温度,温度过高,会使克隆无法筛选。我的方法是对烤箱内的细菌进行高温消毒后,烤箱的温度是55-60度,然后把它们拿出来,这样才能很好地掌握温度。在铺板前后,我们应该用吹风机吹干。对照的设立是为了验证双酶切是否成功。下面小编整理了一些关于酶切连接反应的全部攻略,供大家参考学习!

双酶切连接反应.png

  1、回收PCR产物:在进行PCR扩增时候,给引物两端设计好酶切位点,一般说来,限制酶的 选择非常重要,尽量选择粘端酶切和 那些酶切效率高的限制酶,如BamHI,HindIII,提前看好各公司的双切酶所用公用的BUFFER,以及各酶在公用BUFFER里的效率。选好酶切位点后,在各个酶的两边加上保护碱基。

  双酶切时间及其体系:需要强调的是很多人建议酶切过夜,其实完全没有必要,一般酶切3个小时,其实1个小时已经足够。应用大体系,如100微升。

  纯化问题:纯化PCR产物割胶还是柱式,我推荐柱式,因为割胶手法不准,很容易割下大块的胶,影响纯化效率。现在的柱式纯化号称可以祛除引物,既然如此,酶切掉的几个碱基肯定也会被纯化掉了。所以,PCR产物和双酶切产物的纯化均可应用柱式纯化。用的是TAKARA的纯化柱试剂盒。

  酶量的问题:以TAKARA的为例,其对1单位酶的定义如下:在50 μl 反应液中,30℃温度下反应1小时,将1 μg 的λDNA完全分解的酶量定义为1个活性单位(U)。 而该酶浓度约为15单位/微升,在除外酶降解的 因素外,该酶可分解15μg的DNA,而一般从1-4ml菌液提出的 DNA约为3μg,而PCR纯化后的产物(50体系)约为3μg,所以即便全部加进去,只要纯化的 质量好,酶切完全切得动。

  2、酶切、回收后的PCR产物与载体的连接

  摩尔比的计算,很多人凭经验也可以。但对于初学者从头认真计算则 非常有必要。回收的载体片段:回收的PCR产物片段=1:10 ,一般取前者0.03pmol,后者取0.3pmol。

  pmol为单位的DNA转换为为µg单位的DNA:(X pmoles×长度bp×650)/ 1,000,000 (注:长度bp×650是该双链DNA的分子量)所得数值即为µg,也可以直接用这个公式套.1pmol 1000bp DNA=0.66μg,如载体是5380bp,则0.03pmol为 0.03×5.38×0.66=0.106524µg。

  测DNA浓度可以在专用机子上测,注意OD值,一般约1.8-2.0.另外,如果嫌麻烦,也可用MARKER进行估测,如MARKER2000,5微升的 MARKER每个条带约50ng。

  连接反应:TAKARA的 连接酶上的 说明写的过夜,而其对连接酶单位的定义为:在20 μl的连接反应体系中,6 μg的λDNA-Hind III的分解物在16℃下反应30分钟时,有90%以上的DNA片段被连接所需要的酶量定义为1个活性单位(U)。而它的浓度为350 U/μl ,所以完全够用。连接酶容易失活,注意低温操作,最好在冰上。时间3个小时足已。

  3、转化:

  a、全量(10 μl)加入至100 μl JM109感受态细胞中,冰中放置30分钟。

  b、42℃加热45秒钟后,再在冰中放置1分钟。

  c、加入890 μl AMP阴性培养基,37℃振荡培养60分钟。

  取100μl铺板。也可离心后余100μl

  几个非常重要的问题:

  (1)做转化的时候,进行酶连接反应时,注意保持低温状态,因为LIGASE酶很容易降解.为保险起见,一般连接3小时,16度。

  (2)对照的设立:为验证双酶切是否成功,可做如下对照:酶切反应时加各单酶分别切,两管,用同一种BUFFER,跑胶,看单切的两管是否成线性.如两管均成线性可初步判断双酶切成功。

  做转化时,也要进行对照,设4个:

  A.即拿双酶切的质粒产物也进行连接反应,这个对照可进一步看双酶切是否成功,如果长出克隆,说明很有可能只进行了单酶切,如没长出克隆,则证明双酶切成功,当然要保证感受态,培基,连接酶都'正常'的情况下.

  B.酶切过的未进行连接反应的双酶切产物,进行转化,这一步可以证明是否有残留的未被任何酶切的原始质粒

  C.设原始质粒为对照,意为检测整个操作过程中是否有误.

  D.AMP阴性板上用同一批感受态细胞铺板20微升足够,检测感受态状况.

  以上就是关于双酶切连接反应的全部攻略,内容仅供参考,如果有其他问题可以发布到我们网站,与科研大咖一起探讨!


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